وسم–العقدية
وسم - عقدية هو أسلوب يسمح بتنقية وكشف البروتين بواسطة التقارب اللوني , مصنف العقديات هو بيبتيد اصطناعي مكون من ثمانية
أحماض أمينية (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) تنجذب سلاسل البيبتيد لسلاسل المخالفة لها Strep-Tactin وتحديدا البروتين رباعي التقسيم
وكذلك نهايات -N- , C تنصهر مع بعضها مكونة البروتين .
العقديات البروتينية قد تنعزل عند تحلل الخلية الأصلية وذلك لبقائها أسفل خيوط الخلية ,ولها وظائف فسيولوجية
وسم – العقديات و تطور الكيمياء الحيوية
مصفوفة ثنائية التقاطع لترتيب بروتينات الاستريبتافيدين (الإنجليزي Streptavidin ) في Streptomyces avidinii وذلك لتناسب الفيتامين d- البيوتين
Streptavidin يستخدم عادة في علم الأحياء الجزيئي والتكنولوجيا الحيوية . اختير وسم- العقديات كمكتبة للجينات ولربط الأجسام المضادة streptavidin .
على مر السنين سيكون وسم - العقديات نظاما مثاليا يعمل على تسهيل اختيار مواقع الإرفاق ,وتفاعل الأجسام المضادة Streptavidin يجعله مثاليا لزيادة روابط البيبتيد وبالتالي تطوير Strep-Tactin
نظام Strep-tag يتكون من Strep-tag وكذلك Strep-Tactin وقد ثبت أنه مفيد لتوظيف الجسيمات العازلة وتحليل مركبات البروتين في البحث البروتيني.
وسم – العقديات الرئيسي
يسهل تهجين البروتين للمورثات أو إكمال احمض نووي , وبتعبير مختلف يسمح بنقل الكائنات الحية المفردة (خلايا الثدييات , الحشرات , الخميرة ) , الجسيمات المصنفة عقديا صغيرة الحجم وحقيقية وهي تقريبا خاملة كيميائيا .
الإفرازات أو العقد البروتينية لاتؤثر ولا تساهم في وظائف البروتين.
Strep-tag مناسب لتحليل وظائف البروتين لأن عملية التنقية تكون تحت ظروف فسيولوجية وهي لاتتيح فقط عزل البروتين الحساس في المستويات الأصلية بل كذلك ينقي التجمعات البروتينية .
دورة التنقية هي الخطوة الأولى وسو-عقدية ,يعمل البروتين على إيجاد علامات عقدية في الخلية المتحللة عندما يؤثر عليها بشكل عمودي ويجمد Strep-Tactin ( الخطوة 1 )
بعد ذلك العلامات العقدية تعمل كروابط مع Strep-Tactin , خطوة الغسل الصغيرة تكون تحت ظروف فيزيائية معزولة حيث تتم إزلة جميع البروتينات المفردة ( الخطوة 2 ) وبشكل استثنائي تنخفض الروابط بين البروتين ,بالتالي تنقى العلامات العقدية بقليل من d-desthiobiotin الذي يرتبط مع البيوتين( الخطوة 3 )
تتم إزالة d-desthiobiotin بإضافة محلول HABA الذي يحتوي على (صبغة الآزو الصفراء), فعند
إزالة d-desthiobiotin يتغير لون الصبغة من الأصفر - البرتقالي إلى اللون الأحمر ( الخطوة 4+5 ) .
وأخيرا يخرج محلول HABA بتحرك الأجسام العازلة الصغيرة .
تطبيقات وسم – العقديات
يمين|تصغير
تنقية البروتين بعد التعليم العقدي يتم بأدوات انتقائية عالية تحت ظروف فسيولوجية , فالبروتين المنتج نشط بيولوجيا ونقي جدا(95%).
أيضا وسم - العقدية يستخدم للكشف عن البروتين في ظروف مختلفة بالاعتماد على ظروف تجريبية ,الأجسام المضادة لـ Strep-Tag أو Strep-Tactin وأدلة الأنزيم (HRP) و (AP) أو( GFP) .
وإذا كان المطلوب درجة نقاء عالية فيتم أولا تنقية بالأجسام المضادة ومن ثم أجسام مضادة أخرى لــ Strep-Tag ,فيقلل التلوث عن طريق روابط البروتين
فيما يلي قياسات أجريت باستخدام Strep-Tag :
- أولا تنقية نسبية
- بروتين : دراسة تفاعل البروتين
- منطقة مستعمرة , شائبة نقطية , شائبة ( لطخة ) غربية وكذلك رابط انزيمي ( ELISA )
- فحص الإستنساخ الإيجابي
- كيمياء ستولوجية مناعية و كيمياء ستولوجية غير مناعية
- استهداف دراسة البروتين الحركي
ولأن Strep-Tag قادر على عزل تجمعات البروتين , وله استراتجية في دراسة تفاعل بروتين – بروتين للتجمعات .
ويتموقف وسم -عقدية البروتينية مع نسب عالية من الأجسام المضادة على صفائح رقيقة أو على شريحة حيوية .
شاهد أيضا
ELISA
المراجع
- Schmidt TGM and Skerra A, 2007. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. NATURE PROTOCOLS 2, 1528-1535.
- www.strep-tag.com
- Skerra,A. and Schmidt, T.G. 2000. Use of the Strep-tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. Methods Enzymol 326, 271-304
- Ostermeier, C., Harrenga, A., Ermler, U. and Michel, H. (1997) Structure at 2.7 Å resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome c oxidase complexed with an antibody Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10547-10553.
- Junttila MR, Saarinen S, Schmidt T, Kast J, Westermarck J. 2005. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 2005 Apr;5(5):1199-203
Strep-tag]]
.jpg){kind=link}
.jpg){kind=link}